0%

关于冠状病毒的一些事情

19年底开始, 从武汉开始爆发了COVID-19 疫情,三个多月过去了,到三月七号世界上的确诊数已经超过了十万。并且显然已经在全球流行起来了。另外我这个学期有两门课程和它有关,所以想了解一下有关知识。在这里做一个记录。

Global Coronavirus Outbreak status from JHU

为了对冠状病毒有一个更为全面的了解,我们先来看一看Fields Virology 6th中冠状病毒科的概况。

Coronaviridae

History&&Classification

冠状病毒是一类有包膜的ss-(+)-RNA病毒,广泛存在于哺乳动物和鸟类中,导致急性或者持续性的感染。冠状病毒早在20世纪三十年代年就被发现了,20世纪六十年代的时候人们认识到冠状病毒可以引起呼吸道疾病并在电子显微镜下进行了观察。这些一类病毒最明显的特征是他们的包膜上有类似于穗的棘突,让整个病毒呈现出一种类似于日冕(solar corona)的形态,因而得名。虽然都是包膜外面有棘突, 但是形态上和正粘病毒科、副粘病毒科还是有一定的差别的冠状病毒棘突之间要稀疏很多。

“orthomyxoviridae”的图片搜索结果 Coronaviridae

自从发现冠状病毒可以感染人类之后,对于冠状病毒的研究主要集中在家畜呼吸道和消化道疾病上。比较典型的动物感染冠状病毒导致的疾病包括鸡的支气管炎,猪的传染性肠胃炎,小鼠的肝炎和神经系统疾病。这提示我们基础研究的重要性,随便搜几个新闻(你看这就全都占了

image-20200308102557900

image-20200308102620594

image-20200308102651615

冠状病毒的分类位置大概如下图所示

Taxonomy of the order Nidovirales

我比较关注的是上图Coronavirinae这一类。这个亚科下面根据主要根据血清型次要根据系统发生分成了Alpha Beta Gamma三个属,(都按照系统发生分类多棒 Alpha、Beta Coronavirus 一般都具有哺乳动物宿主,gammacoronavirus则主要是禽类作为宿主。但是这个分类也许并不是很全面,因为在03年非典之后研究人员从蝙蝠体内通过基因组学的手段从蝙蝠体内分离出许多新的病毒,在鸟类里也找到了许多新的冠状病毒。蝙蝠和鸟能飞翔容易传播,并且有栖息聚集的习惯,皿虫为蛊

从较新的资料来看,冠状病毒亚科已经分为四个属:

Taxonomy

甲型冠状病毒属(Alphacoronavirus;Alpha-CoV)

模式种:甲型冠状病毒1 (Alpha-CoV-1)]

种: 羊驼冠状病毒 (Alpaca-CoV)、甲型冠状病毒1、人类冠状病毒229E (HCoV-229E)、人类冠状病毒NL63 (HCoV-NL63)、长翼蝠冠状病毒1 (Bat-CoV MOP1)、长翼蝠冠状病毒HKU8 (Bat-CoV HKU8)、豚豕流行性腹泻病毒 (PEDV)、菊头蝠冠状病毒HKU2 (Bat-CoV HKU2)、高头蝠冠状病毒512 (Bat-CoV 512)。

乙型冠状病毒属 (Beta-CoV)

模式种: 鼠类冠状病毒 (M-CoV;小鼠肝炎病毒)

种: 乙型冠状病毒1 (Beta-CoV-1)、人类冠状病毒HKU1 (HCoV-HKU1)、鼠类冠状病毒 (M-CoV)、家蝠冠状病毒HKU5 (Bat-CoV HKU5)、果蝠冠状病毒HKU9 (HKU9-1)、严重急性呼吸道综合症病毒 (SARS-CoV)、扁颅蝠冠状病毒HKU4 (Bat-CoV HKU4)、中东呼吸综合症冠状病毒 (MERS-CoV)、人类冠状病毒OC43 (HCoV-OC43)、刺猬冠状病毒1 (EriCoV)、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2型 (SARS-CoV-2)。中华菊头蝠冠状病毒RaTG13 (Bat-CoV RaTG13)。(Bat-SL-CoV ZC45)。

丙型冠状病毒属 (Gamma-CoV)

模式种: 禽类传染性支气管炎病毒 (IBV;鸡传染性支气管炎病毒)

种: 白鲸冠状病毒SW1 (Whale-CoV SW1)、禽类传染性支气管炎病毒 (IBV)。

丁型冠状病毒属 (Delta-CoV)

模式种: 白头鹎冠状病毒HKU11 (Bulbul-CoV HKU11)

种: 鸭类冠状病毒HKU20 (Wigeon-CoV HKU20)[9]、白头鹎冠状病毒HKU11 (Bulbul-CoV HKU11) [8]、豚豕冠状病毒HKU15 (PorCoV HKU15)、文鸟冠状病毒HKU13 (Munia-CoV HKU13) [8][10]、鸫鸟冠状病毒HKU12 (Thrush-CoV HKU12) [8][11]。

能感染人类的冠状病毒并不是很多:

2019新型冠状病毒(2019-nCoV,引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒,其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征) 和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征) ——引自百度百科

臭名昭著的MERS-CoV、SARS-CoV及SARS-CoV-2都属于β属。

Structure

冠状病毒颗粒大致成球形,一定程度上具有多态性。早期文献报道冠状病毒平均直径80~120nm但是在一些特别的情况下可以这个范围可以是50~200nm。后来冷冻电镜的观察结果他们的多态性要小很多,这可能是以前技术不发达纯化、染色制样过程造成的。

冠状病毒的一个典型的特点是具有棘突,棘突常被描述为:

club-like or petal-shaped,emerge from the virion surface as stalks with bulb-like distal termini

即棘突呈现棍状或花瓣状,从病毒粒子的表面突出,棘突远端膨大类似于球茎。针对Alpha、Beta属的通过cyro-EM的研究表明,包含Spike protein的整个virion直径大致在118~136nm而Spike protein 的长度大致在16~21nm

Coronavirus Structure

包膜由磷脂双分子层和膜蛋白组成,包膜的内部是螺旋对称的核衣壳。一般来说这种螺旋对称的结构对ss-(-)-RNA病毒很常见,而对于正链RNA病毒则比较特殊(一般为二十面体对称)。组成核衣壳的细丝要稍微比福年病毒细一些,直径在9~13nm。但是这些结构的尺寸常常受到病毒的种类和观察时候制样方法影响,并且这些细丝本身具有柔性容易弯曲。有研究表明这些螺旋的细丝会形成线圈或者其他的结构发生各种各样的折叠,但具体的结构还需要进一步的研究。

冠状病毒主要的结构蛋白包括:

  • M: Membrane protein
  • S: Spike protein
  • E: Envelope protein
  • N: nucleocapsid protein

Structure Proteins

这里比较重要的是S蛋白。 S蛋白由S分子组成三聚体,属于第一类病毒融合蛋白,可以结合在宿主细胞的手提上来介导早期感染。这里有必要说明一下病毒融合蛋白的种类。

Class I: Priming by cleavage of trimeric, single-chain precursor

Class II: Priming by cleavage of heterodimeric partner protein (“chaperone”)

Class III: Triggering but no priming

from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4424100/

S分子单体是一个128~160kDa的跨膜蛋白,N末端的胞外域比较大而C末端的胞内结构域很小。S蛋白通过信号肽切割插入到内质网上,完成N-连接的糖基化。但是S蛋白糖基化很复杂,早期的一些反应早在转录阶段就进行了。S蛋白的折叠伴随着二硫键的形成,所以S蛋白的半胱氨酸保守性很好。

在许多beta和gamma属的冠状病毒中,S蛋白会被宿主体内的furin样蛋白水解成为两个多肽S1和S2,S1域相对变化较大而S2域较为保守。S蛋白被认为和流感病毒的HA蛋白功能上非常类似。

M蛋白是冠状病毒中含量最丰富的蛋白质,冠状病毒中最丰富的结构蛋白-M蛋白-赋予病毒颗粒其形状。M单体的范围为25至30 kDa,是一种被三个跨膜结构域包埋在包膜中的多聚膜蛋白。其胞外域被N-糖基化修饰,
M蛋白在属内均具有良好的保守性,但在整个属间差异很大。

E蛋白是一种8至12 kDa的小多肽,在病毒颗粒包膜中数量有限,对冠状病毒的感染至关重要。即使在紧密相关的冠状病毒中,E蛋白序列也有很大差异。所有的E蛋白都有一个共同的结构:一个短的亲水性氨基端,然后是一个大的疏水区域,最后是一个大的亲水性C末端尾巴。E是完整的膜蛋白,但是它没有可裂解的信号肽,并且没有糖基化。

一般来说,正链RNA病毒是没有N蛋白的,如小RNA病毒科和杯状病毒科。这种差异可能是因为冠状病毒的基因组比较长。

N蛋白位于病毒体内部,是螺旋核衣壳的唯一蛋白成分。其单体的大部分由两个独立折叠的域组成:N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)。大多数N分子是高度碱性的; 相反,结构域3是酸性的。 N蛋白是磷蛋白,在有限数量的丝氨酸和苏氨酸残基上被修饰。N蛋白最显着的功能是与病毒RNA结合。核衣壳的形成必须同时涉及RNA结合的序列特异性和非特异性模式.

Genome Structure and Organization

冠状病毒基因组大约26~32kb,是RNA病毒种最大的。这种RNA分子至少具有三种功能:作为感染周期的初始mRNA,作为RNA复制和转录的模板以及作为包装成后代病毒的基质。

Genome Structure

冠状病毒的生活史简要如下图:

image-20200327093428802

这里我想借用Virology课程中病毒Replication Cycle的几个过程来作为一个线索:

  • Attachment
  • Penetration
  • Uncoating
  • Genome Replication and Gene Expression
  • Assembly
  • Maturation
  • Release

Attachment

冠状病毒感染是由病毒体与细胞受体结合而引发的。 然后发生一系列事件,最终将核衣壳递送至细胞质。 S1与受体的结合导致构象变化,从而导致由S2介导的病毒粒子与细胞膜融合。

对于本次COVID19 疫情,细胞受体是ACE2,也就是血管紧张素转化酶2。它在调节血压和心脏功能方面有一定作用。在肺和小肠的上皮细胞有大量表达,在心脏肾脏等其他组织也有表达。

Penetration&Uncoating

病毒粒子进入细胞是S蛋白的大规模重排导致病毒和细胞膜融合的结果。这些重排是由受体结合,S的蛋白水解切割和暴露于酸性pH的某种组合触发的。冠状病毒S蛋白是I类病毒融合蛋白。许多冠状病毒的S蛋白在成熟的病毒体中无法裂解,在感染的进入步骤需要与蛋白酶相遇,以分离刺突的受体结合和融合成分。

冠状病毒S2部分包含两个分离的七肽重复序列HR1和HR2,在HR1上游有一个融合肽,在HR2下游有一个跨膜结构域。受体介导的剩余S2三聚体中的主要重排。这些重排最终暴露出融合肽,该融合肽与宿主细胞膜相互作用,并且每个单体中的两个七肽重复序列在一起形成反平行的六螺旋束。

Membrane Fusion Model

对于uncoating 的部分似乎并没有怎么介绍。

Replication & Expression

在将病毒核衣壳递送至细胞质后,下一个事件是来自基因组RNA的复制酶基因的翻译。该基因由两个大的ORF(rep 1a和rep 1b)组成,它们共享一个小的重叠区域。整个复制酶的翻译取决于一种称为核糖体移码的机制,从而使翻译核糖体以固定的概率移位一个核糖体。从rep 1a阅读框到rep 1b阅读框的-1方向。

Rep a/b

该重新定位由两个RNA元件介导,第一个元件是5’-UUUAAAC-3’七核苷酸滑序列,第二个元件位于滑序列的短距离下游,是一个广泛表征的RNA假结结构。这两个元素共同作用以产生共末端多蛋白产品pp1a和pp1ab多肽pp1a(440-500 kDa)和pp1ab(740-810 kDa)可以通过蛋白水解加工成成熟蛋白,命名为nsp1至nsp16。

核糖体移码

对于蛋白酶水解的过程,有两种切割活性。

  • 木瓜蛋白酶样蛋白酶 PL pro,对nsp1/2/3进行分离
  • 主要蛋白酶 M pro, nsp5 执行身下的11个切割事件,也叫做3C蛋白酶(3CL pro),和picornaviridae有一些远距离关系

Replication gene and products

而nsp2目前还没有发现有什么功能。Nsp3是迄今为止最大的RTC蛋白。在nsp3的氨基末端是与SR区相互作用的泛素样(Ubl1)和酸性(Ac)域N蛋白、有可能这种相互作用将基因组束缚于正在组装的RTCReplicase-Transcriptase Complex)以形成用于RNA合成的起始复合物。除了蛋白酶活性,Nsp3还具有去泛素酶活性,

NSP3 of SARS-CoV

nsp12中包含RdRp(依赖RNA的RNA聚合酶),序列比对和同源模建表明nsp12具有几个病毒RdRps和逆转录酶特征的手指,手掌和拇指域。 Nsp12具有异常大的NTD,其中至少一部分介导以RTC为目标。nsp8 也具有RdRp活性,能够合成短的RNA寡聚物,可能是作为primase。

对RNA合成至关重要的另一种酶是nsp13的解旋酶。其活性解开了极性为5’至3’的RNA双链体,表明其作用是在RdRp之前制备模板。 nsp13解旋酶具有仅在尼多病毒中发现的氨基末端锌指结构域。 像许多RNA病毒一样,冠状病毒也包含能够催化mRNA的5’端帽结构合成途径的多个步骤的机制。

RTC的表达和装配为病毒RNA的合成奠定了基础,这一过程导致基因组RNA的复制和多个亚基因组RNA(sgRNA)的转录,后者作为复制酶基因下游基因的表达模板。

RTC究竟长啥样呢?

RTC

RTC有三种结构类型:

  • convoluted membrane(CM)是nsp积累的主要部位;
  • Double-membrane vesicles(DMV) 似乎是活性RNA合成的位点;
    和DMV合并形成的
  • vesicle packets(VP),这是DMV合并后形成的

每个sgRNA均由70至100个核苷酸的前导RNA组成,该核苷酸与基因组的5’末端相同,并与体RNA相连,后者与基因组3’末端的片段相同。 前导RNA与体RNA的融合发生在短基序TRS上。

【这个过程比较复杂,以后再补充一些】

Assemble & Release

转录的直接结果是使能够翻译构建后代病毒的蛋白质。膜结合蛋白M,S和E最初插入ER; 从那里,它们转移到病毒体组装位点,即内质网-高尔基体中间区(ERGIC)。在这里,由N蛋白衣壳化的子代基因组组成的核衣壳与包膜成分融合形成病毒体,并萌芽进入ERGIC。E蛋白和M蛋白的共表达足以产生从细胞释放的颗粒,并在形态上与冠状病毒包膜相同。

组装和出芽后,子代病毒体通过被运输到光滑壁囊泡的质膜而从受感染细胞中输出,并通过胞吐作用释放。

PATHOGENESIS & PATHOLOGY

大多数冠状病毒通过呼吸道或粪便-口途径传播到易感宿主,复制首先发生在上皮细胞中。 包括HCoV-OC43和HCoV-229E在内的一些病毒主要在呼吸道上皮细胞中复制,在那里它们产生病毒并引起局部呼吸道症状。其他冠状病毒,包括TGEV,BCoV,猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV),CCoV,FeCoV和MHV肠病毒株,会感染肠道上皮细胞。 其中一些病毒(例如TGEV)在幼小动物中引起的腹泻特别严重,有时甚至致命。除了局部感染呼吸道或肠道外,几种冠状病毒还会引起严重的疾病。 例如,SARS-CoV从上呼吸道传播,导致严重的下呼吸道感染,而FIPV全身传播,从而导致猫科动物普遍性的浪费性疾病。

To be continue